微生物限度检查法步骤

微生物限度检查法通过标准化流程评估非无菌药品、医疗器械等样品中微生物污染程度，核心步骤如下：

一、前期准备与环境控制

‌洁净环境‌：操作需在B级洁净背景下的A级单向流洁净台（如生物安全柜）中进行，定期验证环境悬浮粒子与微生物指标。

‌器具灭菌‌：培养皿、移液管、滤器等需121℃高压灭菌15-30分钟。

‌培养基准备‌：

计数培养基（如胰酪大豆胨琼脂用于需氧菌，沙氏葡萄糖琼脂用于霉菌/酵母菌）需进行无菌性及促生长能力验证；

控制菌检查用培养基（如麦康凯琼脂）需预确认抑制能力。

二、样品制备与稀释

‌供试液制备‌：

‌固体样品‌：取10g样品，加入90ml稀释剂（如pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液），均质制成1:10混悬液；

‌液体样品‌：直接取10ml或稀释至1:10；

‌抑菌性样品‌：添加中和剂（如头孢类需头孢菌素酶）或采用薄膜过滤法去除抑菌成分。

‌系列稀释‌：根据预期污染水平，对1:10供试液进行梯度稀释（1:100、1:1000等）

薄膜过滤法（抑菌性/低微生物样品）

取供试液通过0.45μm滤膜，用pH7.0缓冲液冲洗滤膜（每膜总量≤1000ml）；

滤膜贴于培养基平板，培养条件同平皿法。

四、控制菌检查

‌大肠埃希菌‌：

取供试液接种至含中和剂的胰酪大豆胨液体培养基，30-35℃培养18-24小时；

转接麦康凯液体培养基，42-44℃培养24-48小时，可疑菌落进一步验证。

‌沙门菌‌（特定制剂）：

取10g样品加入TSB培养基，接种菌悬液培养后分离鉴定。

五、结果判定与报告

‌计数结果‌：需氧菌总数、霉菌和酵母菌数以CFU/g（ml）报告，如口服制剂细菌数≤1000 CFU/g；

‌控制菌‌：不得检出大肠埃希菌等致病菌（如胶囊剂每10g不得检出沙门菌）；

‌阴性对照‌：同步操作的灭菌样品应无菌生长，否则试验无效。

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关键注意‌：

全程严格无菌操作，供试液制备至接种需在1小时内完成；

抑菌性样品必须进行方法适用性验证，回收率应为50%-200%