一、准备工作（无菌是关键）

1. 环境与仪器

• 提前 30 分钟开超净台紫外灯灭菌，用 75% 酒精擦拭台面与仪器外壳。

• 连接主机与真空泵，检查管路密封无泄漏；滤杯、底座 121℃湿热灭菌 20 分钟备用。

2. 耗材与试剂

• 备好无菌滤膜（0.45μm，直径 50mm，有网格面便于计数）、无菌培养皿、无菌镊子（酒精灯火焰灭菌）、废液瓶（加消毒液）。

• 准备稀释液（无菌生理盐水）、对应培养基（细菌用 TSA，霉菌 / 酵母用 SDA）、供试品稀释液。

3. 样品预处理

• 液体样品：摇匀后按标准稀释；固体样品：无菌均质 / 浸提后取上清；含抑菌成分的样品需预留冲洗步骤。

二、核心操作步骤（步步有标准）

1. 滤膜安装（超净台内无菌操作）

• 无菌镊子夹取滤膜，有网格面朝上，平整放在滤杯底座支撑筛板上，无褶皱、无气泡。

• 扣上滤杯并旋紧 / 卡紧，确保密封不漏气。

2. 样品过滤（控制流速防破损）

• 无菌转移规定体积的供试品溶液至滤杯，避免液面过高。

• 启动真空泵，打开阀门，控制负压流速（一般 10–30mL/min），防止滤膜破裂或微生物截留不全。

• 样品完全滤过（滤膜无明显水珠）后，先关阀门再关泵。

3. 滤膜冲洗（可选，去抑菌残留）

• 含防腐剂 / 抗生素的样品，用无菌生理盐水冲洗滤膜 3 次，每次 50–100mL，每次冲完再抽干。

4. 滤膜转移与培养（贴平无气泡）

• 无菌取出滤膜，菌面朝上平贴于培养基表面，轻压排尽气泡。

• 培养皿标记样品信息，倒置放入培养箱：细菌 30–35℃培养 3–5 天，霉菌 / 酵母 20–25℃培养 5–7 天。

5. 结果观察与计数

• 培养结束后，计数滤膜上菌落数（CFU），按稀释倍数换算样品微生物限度；记录菌落形态、颜色等特征。

三、收尾与维护（延长仪器寿命）

1. 仪器清理

• 滤杯用中性洗涤剂浸泡后软布擦洗，清水冲净晾干；阳性样品过滤后需 121℃灭菌 20 分钟再清洗。

• 管路用纯化水冲净，废液按生物危害废弃物处理。

2. 日常维护

• 定期检查真空泵负压与管路密封性；滤膜支撑网避免划伤，及时更换老化密封圈。

四、小白避坑指南（关键注意点）

1. 滤膜安装必须平整无褶皱，否则易漏液或菌落重叠，导致计数不准。

2. 过滤流速不能过快，防止滤膜破裂或微生物被冲失。

3. 转移滤膜时避免用镊子划伤膜面，菌面朝上是计数前提。

4. 全程无菌操作，减少环境微生物干扰，必要时做阴性对照（仅过滤稀释液）。